Внимание!
Предложения и заявки заказчиков

Размещение рекламных материалов

коммерческая реализация изобретений - ООО 'Адвансед Девелопмент Проджект' смотреть>>>

Требуются разработки по средствам контроля и ограничения по количеству дисковых операций производимых одним пользователемдля хостинг провайдера. смотреть>>>

Требуются разработки по использованию низкопотенциальной энергии смотреть >>>

включение дейтерий- меченых ароматических аминокислот в молекулу мембранного белка бактериодопсина

МЕТОД ВКЛЮЧЕНИЯ ДЕЙТЕРИЙ- МЕЧЕННЫХ АРОМАТИЧЕСКИХ АМИНОКИСЛОТ L-[2,3,4,5,6-D5]-ФЕНИЛАЛАНИНА, L-[3,5-D2]-ТИРОЗИНА И L-[2,4,5,6,7-D5]-ТРИПТОФАНА В МОЛЕКУЛУ МЕМБРАННОГО БЕЛКА БАКТЕРИОРОДОПСИНА.


Разработан метод получения мембранного белка бактериородопсина галофильной бактерией Halobacterium halobium, меченного дейтерием по остаткам [2, 3, 4, 5, 6-2H5]фенилаланина, [3, 5-2H2]тирозина и [2, 4, 5, 6, 7-2H5]триптофана и его последующее препаративное выделение с выходом 8-10 мг на 1 г бактериальной биомассы. Метод заключается в выращивании штамма галофильных бактерий Halobacterium halobium на синтетической среде с дейтеро-меченными ароматическими аминокислотами, солюбилизацию белка в 0,5%-ном ДНС-Na  и низкотемпературному фракционированию метанолом с последующей экстракцией от каротиноидов, липидов, высоко- и низкомолекулярных соединений, электрофорез в 12.5% ПААГ с 0.1% ДДС-Na и гель-проникающую хроматографию на сефадексе G-200. Включение дейтерий-ароматических аминокислот контролировали методом масс-спектрометрии электронного удара ЭУ после гидролиза белка 4 н. Ba(OH)2 и разделения обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией в виде метиловых эфиров N-Днс-производных аминокислот. Согласно данным масс-спектрометрического анализа, пики молекулярных ионов (М)+ метиловых эфиров N-Днс-производных ароматических аминокислот обладали очень низкой интенсивностью и полиморфно расщеплялись, поэтому области их молекулярного обогащения были сильно уширены. Кроме этого, масс-спектры компонентов смеси аддитивны, поэтому смеси можно анализировать, только если имеются спектры различных компонентов, записанные в тех же условиях. Проводимые вычисления предусматривают решение системы из n уравнений с n неизвестными для смеси из n компонентов. Для компонентов, концентрация которых превышает 10 мол.%, правильность и воспроизводимость результатов анализа составляет +0.5 мол.% (при доверительной вероятности 90%). Поэтому для получения воспроизводимого результата необходимо хроматографически выделять индивидуальные производные 2Н-меченых аминокислот из белкового гидролизата. Для решения поставленной задачи мы использовали метод обращенно-фазовой ВЭЖХ на октадецилсилановом селикагеле силасорб С18, эффективность которого подтверждалась разделением смеси метиловых эфиров N-Днс-производных дейтерий-меченых аминокислот из других микробных объектов, как метилотрофные бактерии и микроводоросли. Метод удалось адаптировать к условиям хроматографического разделения смеси метиловых эфиров N-Днс-производных аминокислот гидролизата БР, заключающийся в оптимизации соотношения элюентов, форме градиента и скорости элюции с колонки. Наилучшее разделение достигалось при градиентной элюции метиловых эфиров N-Dns-производных аминокислот смесью растворителей ацетонитрил : трифторуксусная кислота = 100 : 0.1 - 0.5, об.%. При этом удалось разделить триптофан и трудно разрешимую пару фенилаланин/тирозин. Степени хроматографической чистоты выделенных метиловых эфиров N-Днс-[2, 3, 4, 5, 6-2H5]фенилаланина, N-Днс-[3, 5-2H2]тирозина и N-Днс-[2, 4, 5, 6, 7-2H5]триптофана составили 89, 91 и 90% при выходах 78-85%. Предложенный метод биосинтеза дейтерий-меченного бактериородопсина свидетельствует о высокой эффективности мечения белка по остаткам дейтерий-меченных ароматических аминокислот. С помощью разработанного метода можно получить 8-10 мг дейтерированного бактериородопсина из 1 г биомассы. Метод также применим к получению и других дейтерий-меченных мембранных белков. В дальнейшем планируется получать по разработанному методу полностью дейтерированные препараты бактериородопсина  для реконструкции функционально активных систем мембранных белков в тяжёлой воде с участием дейтерий-меченных липидов и других дейтерированных биологически активных соединений. Эти исследования позволят дать ответ на вопрос как функционирует дейтерий-меченный бактериородопсин в составе нативных мембран в условиях, близким к адаптации клетки к тяжёлой воде.


Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова, 117571, г. Москва, просп. Вернадского, д.86.


Список литературы
1. Мосин О.В., Егорова Т.А., Чеботаев Д.В., Складнев Д.А., Юркевич А.М., Швец В.И. // Биотехнология. 1996. N 4. С. 27-35.  
2. Karnaukhova E.N., Niessen W. M.A., Tjaden U.R. // Anal. Biochem. 1989. V. 181. N 3. P. 271-275
3. Мосин О.В., Складнев Д.А., Егорова Т.А., Швец В.И. // Биоорган. химия. 1996. Т. 22. N 10-11. С. 856-869.
4. Mosin O.V., Karnaukhova E.N., Pshenichnikova A.B., Reshetova O.S. Electron impact mass-spectrometry in bioanalysis of stable isotope labeled bacteriorhodopsin / in: 6th Intern. Conf. on Retinal proteins. 1994. Leiden, the Netherlands, P. 115.
5. Мосин О.В., Складнев Д.А., Швец В.И. // Приклад. биохим. микробиол. 1999. Т. 35. N 1. С. 34-42.

Добавить комментарий


Защитный код
Обновить

Комментарии